нитрификация

Примерно год назд в статье для AFM я детализировал результаты некоторых из моих исследований по микробиологической экологии аквариумных биофильтров. В тех исследованиях я показал, что нитрит-окисляющие бактерии в пресноводных и морских аквариумах не принадлежат роду Nitrobacter. Используя комбинацию нескольких методов молекулярной биологии, я продемонстрировал, что, вероятнее всего, за окисление нитритов в аквариуме ответственны новые неидентифицированные бактерии.
В этом месяце я представлю вам эти новые микроорганизмы. Заклинание, котрое повторялось сотни раз в день, звучало так: азотный цикл это окисление аммония до нитритов бактриями рода Nitrosomonas и последующее окисление нитритов до нитратов бактериями рода Nitrobacter.
Эти бактерии важны для аквариумистов, поскольку без них мы были бы обречены и на частые (скорее всего, ежедневные) замены воды и на очень низкую плотность заселения аквариума рыбами. Пока достаточное количество этих бактерий не установится в аквариуме, количество рыб должно быть ограничено, иначе слишком много аммония (и нитритов) будет произведено, причиняя вымирание рыб. Есть несколько коммерческих бактериальных препаратов нитрификаторов. Большинство этих смесей, как нас уверяют, содержат миллионы и биллионы клеток Nitrosomonas и Nitrobacter.
Все вышеперечисленное верно, но не все применимо к аквариуму. Виды бактерий Nitrosomonas действительно окисляют аммоний, а виды Nitrobacter окисляют нитриты - просто они не делают этого в пресноводных аквариумах, а Nitrobacter не делает этого и в морских. Более того, добавление Nitrosomonas и Nitrobacter из флакона не влияет на микробиологический состав в аквариуме.
Откуда же появились утверждения о том, что эти бактерии производят работу в аквариуме? Одна из причин - это тенденция некоторых компаний, которые изобретают, тестируют и продают препараты, теоретически переносить результаты их исследований, проведенных в пробирках, флаконах и чашках Петри, на аквариумную среду. Они считают, что то, что работает на лабораторном столе, должно так же работать в аквариуме с рыбами - и это ошибка.
Моя работа отличается тем, что я не делаю никаких предположений относительно того, какие виды бактерий важны. Я работаю скорее непосредственно с аквариумной средой, а не с пробирками, но я исследую аквариумную среду при помощи мощных аналитических методов молекулярной биологии.
Методы, используемые в моих исследованиях - это создание генетических библиотек, секвенирование ДНК, градиентный гель-электрофорез, молекулярное зондирование и ПЦР. Это все просто термины для описания некоторых из многообразных процедур, используемых в исследованиях. Детали можно найти в официальной публикации моей работы - Hovanec, T. A., L. T. Taylor, A. Blakis, and E. F. DeLong. 1998. Nitrospira-like bacteria associated with nitrite oxidation in freshwater aquaria. Applied and Environmental Microbiology 64:258-264.
Первым этапом исследования было установить, являются ли какие-то из бактерий, присутствующих в аквариумных фильтрах, вероятными нитрит-окислителями.
Чтобы это сделать, надо выделить ДНК из биопленки, растущей на аквариумном биофильтре. При этом получается смесь ДНК разных видов бактерий. Чтобы от этого была какая-то польза, надо разделить ДНК по отдельным видам бактерий. Это делается при помощью методов клонирования.
В конце концов, Вы получаете сотни клеток, которые надо проверить. Многие из клеток могут содержать идентичные фрагменты ДНК, так что надо тщательно исследовать каждую клетку. Чтобы должным образом исследовать клетки, надо секвенировать ДНК. В настоящее время, это уже не так трудно, но даже с автоматизированными аппаратами это занимает много времени.
Из данных ДНК я обнаружил, что не было никаких последовательностей, родственных Nitrobacter winogradskyi и близким формам. Однако, присутствовала последовательность, родственная известным нитрит-окисляющими бактериями видов Nitrospira. На сегодня известно 2 вида Nitrospira - Nitrospira marina и Nitrospira moscoviensis. Организм, который я нашел, был близко родственен с обоими из них. Эта группа нитрит-окисляющих бактерий сильно отличается, основываясь на последовательностях ДНК, от более широко известного Nitrobacter и помещена в отдельный таксон - Nitrospira.
По крайней мере, теперь у меня была возможная бактерия из фильтров, родственная с известными нитрит-окисляющими бактериями. Затем я должен был определить, присутствовали ли эти бактерии в некоторых, многих или всех пресноводных и морских аквариумах. Поэтому, я разработал два молекулярных зонда для бактерий Nitrospira. Молекулярные зонды - это короткие фрагменты ДНК, <подходящие> оределенному организму (бактериям Nitrospira в данном случае), которые посредством определенных лабораторных методов могут использоваться, чтобы указать не только присутствие или отсутствие этого организма, но также и его относительные количества. Этим способом можно сравнить количество на одном биофильтре или субстрате с количеством на другом.
Я сделал множество тестов с молекулярными зондами для Nitrospira, чтобы удостовериться, что они были специфичными для этих бактерий. Затем я исследовал большое количество и много типов материалов аквариумных биофильтров на предмет присутствия Nitrobacter и Nitrospira. Пресноводные и морские аквариумы, ДНК из грунта аквариумов, из губок, из сред механической фильтрации, из фильтровальных сеток и т.п.
Ни в одном образце я не нашел доказательств присутствия Nitrobacter - ни в одном аквариуме, ни на одном субстрате. Однако, в каждом случае я обнаруживал присутствие бактерий Nitrospira.
Таким образом, результаты показывают, что Nitrobacter не являются нитрит-окисляющими бактериями в фильтрах аквариумов. Вероятнее всего, эта работа осуществляется Nitrospira-подобными бактериями.
Последним тестом, который я провел и о котором сообщил, было исследование эффективности внесения бактериальной добавки в аквариумы в течение фазы запуска. Используя предварительно описанные молекулярные методы, я сравнивал микробное сообщество, которое развивалось в аквариумах, обрабатываемых еженедельно промышленными бактериальными добавками согласно инструкциям изготовителей, с микробным сообществом в аквариумах, не обрабатываемых препаратами. Параметры воды замерялись трижды в неделю.
Результаты заключались в том, что я не обнаруживал Nitrobacter ни в одной ситуации, но я обнаруживал Nitrospira-подобные бактерии в обоих случаях. Таким образом, даже при добавлении препарата Nitrobacter к системе, он не в состоянии заселиться. Возможная положительная роль добавления препарата была в том, что увеличивалось количество Nitrospira-подобных бактерий в аквариумах, обработанных препаратами Nitrobacter. Требуется больше статистических данных, но, кажется, добавка действует наподобие <удобрения>. Я предполагаю, что в добавке есть питательные вещества, которые Nitrospira-подобные бактерии могут использовать так, что их число увеличивается быстрее. Является ли это увеличение значительным или нет, я не могу ответить в данное время. А кроме того, концентрация нитритов в аквариумах, обработанных препаратом, все равно возрастала до токсичных уровней, так что препарат не устранял синдром нового аквариума.
Конечно, есть люди, которых мои результаты не обрадовали - они предпочитают верить, что Nitrobacter являются нитрит-окисляющими бактериями в аквариуме. Тем не менее, они не предоставляют никакого научного доказательства для таких заключений. Кроме того, со времени публикации моей статьи, было по крайней мере три других научных статьи, которые также демонстрировали, что Nitrospira-подобные бактерии, а не разновидности Nitrobacter являются нитрит-окисляющими бактериями в различных водных средах. Эти исследования были сделаны на установках для очистки сточных вод и установках аквакультуры.
Nitrospira: настоящая нитрит-окисляющая бактерия в аквариумах
Биофильтрация - это критический элемент фильтрации в любом аквариуме. Независимо от того, что служит биофильтром, биологическое окисление аммония до нитритов и нитритов до нитратов необходимо, чтобы удерживать эти вещества от достижения токсичных концентраций и уничтожения обитателей вашего аквариума.
То, что два типа бактерий ответственны за нитрификацию, было догмой и в биологии, и в аквариумном хобби. Nitrosomonas europaea окисляет аммиак до нитритов, а Nitrobacter winogradskyi окисляет нитриты до нитратов. Эти организмы называют нитрификаторами и классифицированы как принадлежащие к одному семейству бактерий (но последние работы по филогении этих организмов и их ближайших родственников показали, что эта классификация ошибочна и должна быть пересмотрена).
Эффективность биофильтра обычно оценивают с точки зрения эффективности удаления аммония и нитритов. Количество бактерий, ответственных за осуществление этой работы, не определяют из-за трудностей, связанных с идентификацией и подсчетом. Однако, современные методы молекулярной биологии позволяют количественно оценить нитрифицирующие бактерии, в некоторых случаях - отдельно по видам, так что можно не только измерить увеличение их количества со временем, но и определить, где именно в фильтре они предпочитают жить.
Работа, о которой я рассказываю в этой статье - Hovanec, T. A., L. T. Taylor, A. Blakis, and E. F. DeLong. 1998. Nitrospira-like bacteria associated with nitrite oxidation in freshwater aquaria. Applied and Environmental Microbiology 64:258-264. Результаты, описанные в ней, частично являются продолжением более ранней работы - Hovanec, T. A. and E. F. DeLong. 1996. Comparative analysis of nitrifying bacteria associated with freshwater and marine aquaria. Applied and Environmental Microbiology 62:2888-2896.
Первым этапом исследования было установить, кто фактически является нитрит-окисляющими бактериями в аквариумах. Более ранняя работа показала, что Nitrobacter winogradskyi и близкородственные формы не присутствуют в измеримых количествах в пресноводных и морских аквариумах.
Затем по данным ДНК я установил отсутствие последовательностей Nitrobacter winogradskyi и близкородственных форм, но присутствие последовательностей нитрит-окисляющих бактерий Nitrospira.
Потом я разработал молекулярные зонды, позволяющие определять количества бактерий в образцах. Затем нуклеиновые кислоты из многих различных аквариумов (пресноводные, морские, с рыбой, обработанные хлористым аммонием ammonium chloride, с разной плотностью заселения рыбами и т.п.) я исследовал молекулярными зондами. Ни в одном случае я не обнаружил Nitrobacter, но везде я нашел доказательства присутствия Nitrospira.
Итак, далее, я хотел проверить, можно ли установить, когда Nitrospira-подобные бактерии появляются в новом фильтре и соотнести их появление с параметрами воды. Т.е., можно ли установить корреляцию между появлением Nitrospira-подобных бактерий и окислением нитритов до нитратов. Для этого я использовал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод позволяет умножить количество целевой ДНК в образце. Затем продукт ПЦР я пропустил через аппарат для градиентного гель-электрофореза (DGGE). При этом индивидуальные фрагменты ДНК разделяются в геле, так что можно видеть полосы, соответствующие интересующим вас бактериям. Эти полосы могут затем быть вырезаны, очищены и секвенированы. Это один из способов установить, какой вид бактерий представлен полосой. При комбинировании данных генетических библиотек и электрофореза вы получаете строгие доказательства относительно состава бактериального сообщества в системе. При электрофорезе можно запустить несколько образцов одновременно вместе с контрольными, а из данных секвенирования я знал, какая полоса геля могла бы соответствовать Nitrospira-подобным бактериям.
Итак, я провел 2 эксперимента. В одном я запустил аквариумы и они функционировали около 140 дней, а я отбирал бактериальные образцы каждые 7 дней. В другом я запустил аквариумы и они функционировали 35 дней, а я отбирал бактериальные образцы каждый день. В обоих экспериментах я отбирал образцы воды (3 раза в неделю для первого эксперимента и ежедневно - для второго) и анализировал их на содержание аммония, нитритов и нитратов.
Используя гель-электрофорез, я проверил образцы, усиленные методом ПЦР на предмет того, какой получается набор полос. В первом эксперименте Nitrospira-подобные бактерии не появлялись примерно до 22-го дня. После этого они оставались в образцах и присутствовали в больших количествах, что доказывалось интенсивностью полос. Во втором эксперименте Nitrospira-подобные бактерии появлялись на 12-ый день, в этот же день происходило увеличение нитратов в образцах. К 18-му дню сигнал был довольно сильным, а параметры воды свидетельствовали, что нитраты быстро возрастают.
Таким способом я смог показать корреляцию между появлением Nitrospira-подобных бактерий в образцах (а значит - в фильтре) и преобладанием определенных параметров воды в аквариуме.
Кто же является аммоний-окисляющей бактерией?
На протяжении более, чем 30 лет в сотнях книг и журналов по аквариумистике писали, что бактерии, окисляющие аммоний до нитритов принадлежат роду Nitrosomonas, и даже , что это точно вид Nitrosomonas europaea. Но фактически было мало иследований, демонстрирующих, верно ли это. Однако, несколько лет назад я опубликовал статью о некоторых экспериментах, которые я осуществил с использованием современных молекулярных методов для идентификации аммоний-окисляющих бактерий в аквариуме. Результаты тестов показали, что Nitrosomonas europaea и родственные формы не обнаруживаются в биофильтрах аквариумов.
Для тех, кто хочет посмотреть статью - Hovanec, T. A. and E. F. DeLong. 1996. Comparative Analysis of Nitrifying Bacteria Associated with Freshwater and Marine Aquaria. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 62:2888-2896. Для те же, кто не хочет ломать голову над научной статьей, я написал популярную версию для аква-хоббистов, которая была опубликована двумя частями в Aquarium Fish Magazine.
Суть статьи заключалась в том, что в пресноводных аквариумах бактерии, родственные Nitrosomonas europaea не обнаруживались. Не мог я обнаружить и какой-либо другой вид аммоний-окислителей, хотя параметры воды свидетельствовали, что аммоний (и добавленный в аквариум в виде хлорида аммония и выделяемый рыбами) быстро превращался в нитраты, конечный продукт нитрификации. Я не мог обнаружить, кто фактически осуществлял эту работу и я все еще ищу ответ на этот вопрос сегодня.
Итак, почему предполагалось, что аммоний-окислителем является Nitrosomonas europaea? Потому, что, помимо всего прочего, это бактерии, которые считались окислителями аммония на установках по очистке сточных вод. Проблема такого подхода в том, что обнаружение бактерии в одной среде, содержащей предпочитаемый бактерией субстрат, не означает автоматически, что она будет найдена в другой среде, содержащей такой же субстрат. Помимо этого, никто ведь не доказал, что N. europaea действительно является основным аммоний-окислителем в сточных водах. Фактически, недавние исследования показали, что хотя N. europaea обнаруживаются в бактериальных сообществах сточных вод, они не могут быть основными амоний-окислителями.
Одно из этих исследований - Juretschko, S., G. Timmermann, M. Schmid, K.-H. Schleifer, A. Pommerening-Roser, H.-P Koops and M. Wagner. 1998. Combined molecular and conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 64:3042-3051.
В этом исследовании авторы отбирали образцы на установках по переработке сточных вод и анализировали их несколькими методами. Один из этих методов - т.н. FISH - флюоресцентная in situ гибридизация. Это способ пометить отдельную клетку флюоресцентным зондом, который виден при определенной технике микроскопии. Зонд может подходить определенному виду бактерий или группе родственных бактерий. Используя различные цветные зонды для разных видов или групп можно посчитать отдельные бактериальные клетки по видам в одном образце одновременно. Это важно, так как бактерии весьма похожи, так что отличить разные виды сложно. Исследователи смогли разработать FISH-зонды для разных групп аммоний-окисляющих бактерий, чтобы посмотреть, кто присутствует в образцах.
Они также исследовали нуклеиновые кислоты, выделенные из образцов. И, наконец, они пытались вырастить бактерии из образцов на обогащенных средах.
Результаты их исследований показали, что было, по крайней мере 3 различных группы аммоний-окисляющих бактерий. Одна группа состояла из бактерий, близко родственных Nitrosomonas europaea. Но она не была численно доминирующей, составляя от 16 до 20% клеток в образце. Напротив, самые многочисленные аммоний-окисляющие клетки были родственны Nitrosococcus mobilis. Третья группа аммоний-окисляющих бактерий, видимо, включала новую нехарактеризованную бактерию (или бактерии), которую они не смогли культивировать. Итак, хотя Nitrosomonas europaea и родственные формы присутствовали в образцах, они не были самыми многочисленными.
Другая интересная находка состояла в том, что, когда исследователи выращивали бактерии на обогащенных средах, они обнаружили, что количество N. europaea возрастает до 50%, в то время, как количество Nitrosococcus mobilis снижается до 50%. Это свидетельствует, что культивирование оказывает селекционное влияние на бактерии. Эти результаты также были продемонстрированы ранее другими исследователями. Это значит, что когда вы пытаетесь изолировать и вырастить аммоний-окислителей, N. europaea растут лучше других видов именно на лабораторных обогащенных средах и могут численно доминировать в сосуде, хотя они не являются доминирующими в естественных условиях. Поскольку большинство выводов о том, какие виды бактерий важны для различных биогеохимических и промышленных процессов были сделаны по результатам выращивания на обогащенных средах в лабораториях, следует хорошенько призадуматься, сколь многое было упущено из виду.
Важно знать, кто действительно ответственен за нитрификацию, т.к. чтобы подражать природе мы должны понимать, что мы пытаемся копировать. Есть много видов бактериальных добавок для быстрого запуска или ускорения периода созревания нового аквариума. Но что лежит в основе их создания? Просто расфасовать N. europaea и Nitrobacter winogradskyi во флаконы - не работает. Конечно, использование препаратов привлекательно, т.к. никто не любит ждать, но факты таковы, что имеется множество доказательств из разных исследований, показывающих, что нитрифицирующие бактерии не возглавляются только 2 видами - по одному для окисления аммония и нитритов. Более того, вид, который считали важным, может оказаться не тем, который действительно критичен.
В качестве дополнителнього замечания - авторы не обнаружили клетки Nitrobacter в образцах . Но они обнаружили, что около 9% клеток в образцах были Nitrospira-подобными. Это еще один пример, когда Nitrobacter не был обнаружен там, где по предположениям он должен был присутствовать, а нитрит-окисляющим организмом оказались Nitrospira-подобные бактерии. Такие открытия повторялись и во многих других средах. Практически, не остается сомнений, что нитрит-окисляющие бактерие в аквараиумах - представители рода Nitrospira.

Автор: Тимоти А. Хованек (Timothy A. Hovanec, Ph.D.)

P.S.: Очень благодарю людей, которые меня познакомили с этим человеком в 1996 г., а также редакцию Aquarium Fish Magazine и переводчиков которые очень постарались донести исходный текст.

Доктор Тимоти Хованек (Timothy A. Hovanec, Ph.D)

Консультант правительственных контрактов по установкам аквакультуры для выращивания креветок, рыбы и т.п. Научный руководитель Aquaria Inc. Moorpark. CA. Организовал Aquatic Research лабораторию в Aquaria Inc. и лабораторию микробиологической экологии.